1. Nový fibrinolytický enzým (nattokináza) v rastlinnom syre Natto - typická a populárna potravina vyrobená zo sóje v japonskej diéte
  2. Fibrinolytický efekt tradičného japonského jedla "Natto" (nattokináza)
  3. Zvýšenie fibrinolytickej aktivity v krvnej plazme pri perorálnom podávaní nattokinázy 1
  4. Efekt natto diéty na krvný tlak
  5. Efekt NKPC, lieku vyrobeného zo sušeného filtrátu čiastočne destilovaného Bacillus subtilis, na fluiditu krvi
  6. Nový silný fibrinolytický enzým (nattokináza) v rastlinnom syre "Natto"
  7. Trombóza v tehotenstve a jej prevencia
  8. Purifikovaný filtrát z kultúry Bacillus subtilis natto
    Nový druh "nattokinázy"
  9. Nový proteín získaný z Bacillus subtilis natto s antitrombotickými a fibrinolytickými účinkami
  10. NKCP hrá pri prevencii trombózy dvojitú úlohu
  11. Rizikové faktory kardiovaskulárnych ochorení



3. Zvýšenie fibrinolytickej aktivity v krvnej plazme pri perorálnom podávaní nattokinázy 1
Acta Haematol 1990;84:139-143
Hiroyuki Sumi (a ), Hiroki Hamada (b), Koichiro Nakanishi (c), Hajime Hiratani (c)

(a ) Oddelenie fyziológie, Lekárska fakulta, Miyazaki, Japonsko
(b) Oddelenie biochémie, Oklahomská štátna univerzita, Okla., USA
(c) Výskumné biochemické laboratória, JCR Pharmaceuticals, Kobe, Japonsko


Kľúčové slová: Nattokináza, perorálna fibrinolytická terapia, trombolýza, tkanivový plazminogénny aktivátor

Súhrn
Prítomnosť potentného fibrinolytického enzýmu (nattokináza, NK) v tradičnej fermentovanej potravine "natto" bola opakovane publikovaná týmto autorským kolektívom. Je potvrdené, že perorálne používanie NK (alebo natto) vedie k miernemu a častému zvýšeniu fibrinolytickej aktivity v plazme, čo je dokázané meraním fibrinolytických parametrov a produkciou tkanivového plazminogénneho aktivátora. NK kapsule boli perorálne podávané aj psom s experimentálne indukovanou trombózou a angiograficky bolo dokázané rozpustenie prítomných trombov. Dosiahnuté výsledky dovoľujú predpokladať, že NK predstavuje možný liek použiteľný nielen pre liečbu trombembólie, ale aj na prevenciu tohoto onemocnenia, NK je liek s potvrdenou bezpečnosťou a môže byť masovo vyrábaný.

Úvod
Fibrinolytická terapia pri perorálnom podávaní bola skúmaná Sumi a spolupracovníkmi (1,2) pred 10 rokmi na zvieracích modeloch, keď boli normálnym, zdravým pokusným zvieratám a experimentálnym psom s trombózou v . saphena podávané enterosolventné lieky s urokinázou (UK). Naše predchádzajúce zistenia viedli k záverom, že intravenózne (i .v .) podávanie nedokázalo žiaden jasný trombolytický efekt, avšak perorálne užívanie zvyšovalo fibrinolytickú aktivitu, čo je možné využiť pri rozpúšťaní trombov pri miernej, ale stálej liečbe.

Mechanizmus takejto fibrolytickej aktivity pri perorálnom užívaní bol potvrdený základným výskumom zahrňujúcim absorpciu podanej UK v celom tráviacom trakte a uvoľňovanie endogénneho plazminogénneho aktivátora do krvného obehu, produkovaného pečeňou a /alebo bunkami endotélia (3-6). Enterosolventné kapsule obsahujúce UK (60,000 U/deň počas 7 dní) vykazovali aj klinickú účinnosť pri cerebrálnej trombóze (7, 8). Efektívnejšie výsledky boli dosiahnuté pri dvojito slepých štúdiách v multicentrálnych pokusoch pri použití dávky 120,000 U/deň počas 7 dní (9).

Napriek tomu pretrvávajú určité obavy pri perorálnom užívaní fibrinolytickej terapie. Najväčším problémom bola vysoká cena fibrinolytických enzýmov, ďalším je ich nižšia stabilita v tráviacom trakte. Preto bolo nutné vyskúšať viacero iných fibrinolytických enzýmov vhodných pre perorálne použitie. Pozitívne výsledky neboli dosiahnuté ani pri perorálnom používaní streptokinázy (SK) (10) ani pri fibrinolytickom enzýme Lumbricus rubellus protease (LRP) (11), extrahovateľnom z špeciálneho typu červov, liečbu komplikovali dôkazy o vnútornom krvácaní v gastrointestinálnom trakte.
Počas sérií experimentov sme skúmali účinky viacerých potravín (vrátane alkoholu) na obehový systém (bolo testovaných viac ako 173 druhov prírodných poživatín) a tak sme neočakávane objavili fibrinolytický enzým v japonskom fermentovanom jedle "natto", ktorého enzymatická aktivita bola neporovnateľne vyššia ako u ostatných enzýmov. Izolovaný fibrinolytický enzým sa významne podobal na plazmín. Vykazoval silnú fibrinolytickú aktivitu a bol nazvaný nattokináza (NK) (12). NK je produkovaný mikroorganizmami Bacillus natto a môže byť vyrábaný vo veľkých množstvách. Je extrémne lacný a pomerne stabilný pri zmenách teploty, v kyslom a zásaditom prostredí. Proces purifikácie je veľmi jednoduchý. Najdôležitejsím faktom zostáva, že natto je používané v Japonsku ako denná potrava už viac ako 1000 rokov, čo dostatočne dokazuje jeho bezpečnosť pri perorálnom používaní.

Súčasná štúdia má za cieľ demonštrovať, že pri perorálnom používaní natto a NK môže dôjsť k zvýšeniu fibrinolytickej aktivity v plazme na dlhší čas a že tento fakt je spojený s tkanivovým plazminogénnym aktivátorom (TPA) ako endogénnym plazminogénnym aktivátorom.

Časť týchto údajov bola prezentovaná počas 9. medzinárodného kongresu o fibrinolýze, Amsterdam, 1988, Súhrn H. Sumi, H. Hamada a H. Mihara, Nový silný fibrinolytický enzým (nattokináza) v rastlinnom syre natto, strana 67.

Materiál a metódy
Príprava nattokinázy NK bol extrahovaný nasledujúcim spôsobom (12). Do 5 kg Natto, získaných od národnej federácie výskumu Natto, boli pridané 4 litre destilovanej vody a zmes bola miešaná pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Extrakt bol vystavený pôsobeniu 25 % etanolu. Po odobratí plávajúcich zvyškov bol extrakt filtrovaný cez gázu a centrifugovaný počas 10 min. pri otáčkach 3000 otáčok/ min. Výťažok získaný touto procedúrou bol následne lyofilizovaný (približne 2,13 cu/mg proteínu pri použití ľudského plazmínu ako štandardy). Molekulárna váha bola približne 20 000 daltonov a proteín nereagoval s UK alebo s TPA protilátkami podľa Ouchterlona alebo pri použití ELISA metód.

Enterosolventné kapsule NK boli pripravené rovnakým spôsobom ako sme opisovali (2). Každá kapsula obsahovala 250 alebo 650 mg NK. Placebové kapsule boli pripravované podobne, ale bez aktívneho ingredientu.

Model experimentálne indukovanej trombózy u psov.
Tieto experimenty boli vykonávané podľa rovnakých postupov (2,13), používajúc štandardné plemeno psov (samci, telesná váha 10,1 - 10,6 kg). Experimentálna trombóza bola indukovaná infúziou bovinného fibrinogénu a trombínu cez vénu saphénu ext.
Následne boli psom perorálne podávané 4 kapsule (250 mg NK/kapsula) alebo placebové kapsule a vykonávalo sa meranie fibrinolytickej aktivity v plazme po predpokladanom dosiahnutí duodena. Trombóza bola vyhodnocovaná angiografiou (13), metódou pri ktorej sa katéter vsunul do femorálnych artérií a následne sa aplikovali 4 ml kontrastnej látky počas 2 sekúnd. Angiogramy boli vyhotovené pred experimentálnym vytvorením trombu a potom v 2,5, 5, 12, 18 a 24 hodín po trombóze.

Perorálne užívanie u ľudí a determinácia fibrinolytickej aktivity.
12 zdravým japonským dobrovoľníkom (6 mužov a 6 žien, vo veku medzi 21-55 rokov), bolo podávané 200 g natto alebo varené sójové bôby (kontrolná skupina) 1x denne pred raňajkami, alebo 2 enterosolventné kapsule obsahujúce NK (650 mg/kapsula), 3x denne po jedle. Vzorky krvi boli pravidelne odoberané a zmiešavané v pomere 10: 1 s antikoagulantom 3,8 % natrium citratum. Vzorky krvi od skupiny používajúcej NK kapsule boli odoberané pravidelne o 10.00 hod. doobeda. Enzymetická hladina v plazme bola určovaná podľa času rozpadu trombu (whole blood clot lysis time WBCLT), podľa metódy Chohan a spol. (14). Plazma bola riedená 10 násobne väčším objemom 0,12 M pufrom octanu sodného. Euglobulínový čas rozpadu (euglobulin lysis time ELT) bol meraný metódou podľa Milstona (15), používajúc prístroj od firmy Shoji Co., Ltd. Japonsko. Euglobulínová fibrinolytická aktivita (EFA) bola určovaná metódou Astrupa a Mullertza (16) aplikovaním výťažku z euglobulínu podľa metody Kluft a spol. (17). Aktivita sa vyjadrovala veľkosťou lyzovanej plochy po aplikovaní 0,03 ml euglobulínového roztoku pri 37oC na dobu 18 hod. Bovinný fibrinogén bol objednaný od firmy Armour co., a bovinný trombín od Mochida Pharmaceutical. Určovanie degradačných produktov z fibrin/fibrinogén (FDP) v sére bolo vykonávané latexovou metódou používajúc FDPL súpravu od Teikoku Laboratories. Odhad TPA antigénu v plazme bol vykonávaný metódou podľa Bergsdorfa a spol. (19), používaním ELISA setu z Biopool Laboratories s melanómovou TPA (jednovláknová forma) ako štandard.

Výsledky
Prvotné vyšetrenie pacientov bolo vykonané pred skúmaním efektu NK. 200 g natto predávaného v Japonsku bolo podané 12 zdravým dobrovoľníkom a následne bola pravidelne vyhodnocovaná fibrinolytická aktivita v plazme. Rovnaké množstvo varených sójových bôbov bolo podané tým istým zdravým dobrovoľníkom po uplynutí 2 týždňového intervalu. Ako je vidieť v tabuľke 1 na rozdiel od kontrolného experimentu vykazujúceho iba miernu variabilitu v získaných výsledkoch (p>0,1), po jednom podaní natto bolo dokázané výrazné skrátenie ELT a elevácia EFA. Zvýšenie plazmatickej fibrinolytickej aktivity pretrvávalo počas dlhšieho intervalu (p<0,005), od 2 do 8 hodín.

Kapsule obsahujúce 1,3 g NK boli podávané 3x denne po jedle. Odber krvi sa uskutočňoval každé ráno o 10.00 hod. a sérum a plazma boli vyšetrované so zameraním na fibrinolytické parametre. Výsledky vyšetrení dosiahnuté pri meraní metódou (WBCLT), kde boli prítomné viaceré inhibítory plazmy indikujú, že neexistuje signifikantný rozdiel medzi hodnotami pred podávaním NK (851 ± 1,032 min) a hodnotami zistenými počas 8 dňa. Jediná hodnota, kde bolo zistená zmena bola počas 2 dňa 623 ± 766 min, ale nie signifikantne dôležitá (p>0,5). Ako je znázornené na obr.1 EFA sa postupne zvyšovalo od 1 až do 8 dňa pri podávaní NK. Hladina FDP v sére bola štatisticky signifikantne vyššia p<0,001 už počas prvého dňa podávania NK v porovnaní s hladinami pred podávaním NK (obr.2). Hladina TPA antigénu, ktorý je známy ako jeden z faktorov spojených s fibrinolytickou aktivitou v krvi, bol tiež signifikantne odlišný (p<0,05) počas dlhého obdobia (obr. 3).

Napriek tomu, že efektivita podávania NK kapsúl bola demonštrovaná iba u malého počtu laboratórnych psov, bola jednoznačne pozorovaná lýza experimentálneho trombu. V skupine psov, ktorým bolo podávané iba placebo neboli zaznamenané zmeny hladín ELT viac ako 60 ± 10 minút, od 2,5 do 12 hodín po podaní placeba. V skupine experimentálnych psov, ktorým bolo podávané perorálne NK bola pozorovaná tendencia skrátenia ELT hladín (zvýšenie fibrinolytickej aktivity) (30±18, 41±13, 54±11, 55±9 minút po 30 minútach 1,3 a 6 hodinách po podaní). Angiografické štúdie odhalili, že v porovnaní s kontrolnou skupinou, kde dokonca aj 18 hodín po podaní neexistoval žiaden dôkaz lýzy, v skupine, ktorej bolo podávané NK bola vyhodnotená kompletná rekanalizácia krvného toku v cieve do 5 hodín od podania NK. Bola dokázaná účinnosť NK ako potentného enzýmu vhodného pre trombolýzu.

Diskusia
TPA a pro-UK boli vyvinuté na liečbu embolizmu vzhľadom k ich efektivite a silnej afinite k fibrínovým depozitom v porovnaní s SK a UK. V súčasnoti sú TPA a pro-UK používané v klinickej medicíne vo forme intravenóznych infúzií. Pokračuje sa vo vývoji ďalších fibrinolytických enzýmov s dlhším polčasom používaním metód génového inžinierstva a chemicky modifikovaných enzýmov ako napr. APSAC (plazminogen-streptokinasa aktivator complex) (20,21). V klinickej praxi však tieto enzýmy nepotvrdzujú očakávanú úroveň trombolýzy. Pri použití týchto enzýmov na trombolytické účely sú nutné extrémne vysoké dávky a dlhá doba používania. Jeden z dôvodov je fakt, že ich polčas rozpadu je veľmi krátky (menej ako 20 min) a veľmi rýchlo po ich užití sú tieto enzýmy degradované alebo eliminované obličkami a pečeňou. Pri zmene enzýmu chemickou modifikáciou alebo génovou manipuláciou vzniká imunologicky cudzí proteín ako napr. SK a iné molekuly. Je známy fakt, že po ukončení podávania UK vzniká tzv. rebound efekt a často sa vyskytuje prechodné predĺženie ELT (6).

Existujú metódy, ktoré dokazujú existenciu endogénnych fibrolytických enzýmov, ktoré slúžia v tele na zefektívnenie rozpúšťania trombov. Pri perorálnom podávaní NK podobne ako UK, ľudské telo používa endogénny plazminogénny aktivátor a tak sa zefektívňuje biologická liečba. Existuje predpoklad, že danú metódu možno použiť aj na prevenciu tohto ochorenia.

Údaje v tabuľke 1 a na obr. 1-3 nám ukazujú, že natto a NK môžu pozitívne vplývať na fibrinolýzu počas dostatočne dlhého času. Existujú pokusy vykonané Fearnley a spol. (22), ktoré poukazujú na diurnálny fibrinolytický rytmus rozpúšťania krvnej zrazeniny. V našich pokusoch, napriek tomu, že fibrinolytická aktivita plazmy bola najnižšia o 18.00 hod. , rozdiel v hodnotách počas 24 hodín nebol dostatočne veľký (p>0,1). Aktivácia spôsobená natto a NK bola oveľa vyššia (p<0,05) počas 2-8 hodiny. Údaje na obr.2 demonštrujú prechodný efekt na sérové FDP. Ukazuje sa, že u zdravých ľudí môže byť zvýšenie FDP spôsobené lyzovaním plazminogénneho aktivátora a rozpadom trombu v cievnom systéme. Zvýšenie plazmatickej aktivity je spôsobené aj absorbciou NK všetkými úsekmi gastrointestinálneho traktu rovnako ako pri perorálnom podávaní UK. Aktivita iných fibrinolytických enzýmov v natto okrem NK nebola vyšetrovaná počas našej štúdie, ale Ohkuro a spol. (23) popisovali pokusy, pri ktorých kŕmili myši a potkany natto baktériami a v ich krvi zistili zvýšenie mukopolysacharidového degradačného lyzozýmu.

Hladina TPA antigénu v plazme je veľmi dôležitá pri posudzovaní efektu perorálneho podávania fibrinolytických enzýmov. Ako vidíme na obr. 3 hladina TPA bola signifikantne vyššia a táto úroveň pretrvávala počas dlhého obdobia. NK nevykazuje žiadnu TPA antigenitu.Tieto výsledky pravdepodobne poukazujú na fakt, že malé množstvá Nk boli absorbované z plazmy alebo lymfy a indukovali syntézu TPA plazmynogénneho aktivátora v pečeni alebo v endoteliálnych bunkách ciev.

UK, SK a LRP sa perorálne používajú už približne 10 rokov, čo je ale oveľa kratší časový úsek ako NK, pretože natto je bežná súčasť potravy v Japonsku už viac ako 1000 rokov s jasne dokázanou bezpežnosťou. Rôzne pozitívne efekty natto na onemocnenia srdca a ciev sú dobre známe a je pravdepodobné, že tieto pozitívne efekty sú spôsobené prítomnosťou NK. Samotné NK môže predstavovať najlepší prírodný liek, ktorý je možné použiť pri perorálnej fibrinolytickej terapii. Existujú dôkazy (25), že UK môže zvyšovať aktivitu mitomycínu C. Nedávne pokusy pri perorálnom podávaní LRP obsahujúcom fibrinolytickú zložku "912" vykonané čínskymi výskumníkmi (26), poukazujú na veľmi dobrý efekt pri liečení jedného typu nádorového ochorenia. V súčasnosti sa vykonávajú ďalšie štúdie, ktorých cieľom je posúdiť možnú potenciu NK ako protinádorového lieku.

Referencie
  1. Sumi,H.Sasaki, K .: Perorálne podávanie urokinázy. 17 kongres internistov a hematológov 1978, Paríž, abstrakt, str. 327
  2. Sumi,H, Toki,N.Sasaki,K .:Robbins,K .C.: Perorálne podávanie urokinázy. Thromb. Res. 20:711-714 (1980)
  3. Robbins,K .C.,Sumi,H. Sasaki,K .,Toki,N., Transport ľudskej urokinázy s vysokou molekulárnou hmotnosťou cez gastrointestinálny trakt u psov a ľudí, v Mannucci, Angelo, urokináza: základné a klinické aspekty, str.673-71 (Academic Press, New York 1982).
  4. Sasaki,K ., Moriyma, S ., Sumi, H., Toki, N., Robbins, K .C.: Transport urokinázy s vysokou molekulárnou hmotnosťou , označenej 125 I cez gastrointensinálny trakt u psov so stimuláciou syntézy a / alebo uvoľnením plazminogénnych aktivátorov. Blood 66:67-75.(1985).
  5. Sumi, H., Seiki, M., Morimoto, N., Tssima, H., Maruyama, M., Mihara, H.: Plazmatická fibrinolýza po intraduodenálnom podávaní urokinázy u potkanov. Enzyme 33:121-127 (1985).
  6. Toki, N., Sumi, H., Sasaki, K ., Boreisha, I ., Robbins, K .C., Transport urokinázy cez intestinálny trakt človeka so stimuláciou syntézy a / alebo uvoľnovania urokinázových proteínov. J.clin.Invest. 75:1212-1222 (1985).
  7. Abe,T., Kayama, M., Naito, I .Kanaza, H., Machino, R., Igata, A ., Tazaki, Y., Kameyama, M., Goto, F., Maezawa, H., Watanabe, H., Urushiyama, K ., Togi, H., Sakuragawa, N., Atarashi, J., Kito, S ., Araki, G., Onodera, H., Otomo, E., Ogaa, N., Klinický efekt urokinázy (60 000 jednotiek/deň) na cerebrálny infarkt: Porovnávacia multicentrálna dvojito slepá štúdia. Blood a Vessels (v japončine) 12:342-358 (1981).
  8. Abe, T.Kazama, M., Kinoshita, T., Naito, I ., Ogushi, T., Yoshimura, Y., Teruya, J., Shimizu, N., Zmena fibrinolýzového systému pri perorálnom podávaní urokinázy u ľudí: dvojito slepá krížová štúdia. Blood and Vessels (v japončine) 13:472-479 (1982).
  9. Zeria Pharmaceutical Co., Ltd.: Klinické skúšanie perorálneho podávania urokinázy (nepublikované) (New York Liaison Office, 1989).
  10. Sumi, H., Perorálne podávanie streptokinázy. Japonsko Tokyo Koho JP 54-28804 (1977).
  11. Mihara, H.Sumi, H., Akazawa, K ., Yoneta, T. , Mizumoto, H., Fibrinolytický enzým extrahovaný z červov. Thromb. Heamostas. 50:258 (1983).
  12. Sumi, H., Hamada, H., Tsushima, H., Mihara, H., Nový fibrinolytický enzým (nattokináza) v rastlinnom syre natto: Typická a obľúbená sójová potrava v japonskej diéte. Experimentia 43:1110-1111 (1987).
  13. Sasaki, K ., hatsuoka, M., Toki, N., Sumi, H., Makita, T., Fibrinolytická a koagulačná aktivita počas tvorby experimentálneho trombu v . saphena u psov. Life Sci. 27:1659-1665 (1980)
  14. Chohan, I .S ., Vermylen. J.U., Singh, I ., Balakrishnan, K ., Verstraete, M.: Použitie octanu sodného ako pufra: rozpúšťadlo voľby v technike rozpúšťania zrazeniny. Thromb. Diath. Heamorrh. 33:226-229 (1975).
  15. Milstone, H., Faktor normálnej ľudskej krvi podieľajúci sa pri fibrinolýze streptolyzínom.J.Immun. 42:109-116 (1941).
  16. Astrup, T., Mullertz, S ., Metóda štandardného fibrínového sklíčka pre skúmanie fibrinolytickej aktivity. Arch Biochem. Biophys. 40:346.351 (1952).
  17. Kluft, C., Brakman, P., Veldhuyzen-Stolk, E.C.: Skríning fibrinolytickej aktivity v euglobulínovej frakcii plazmy na štandardnom fibrínovom sklíčku. Davidson, Samama, Desnozers, profres v chemickej fibrinolýze a trombolýze, vol. 2, str. 57-65 (Raven Press, New York 1976)
  18. Garvey, M.B., Black, J.M.: Detekcia fibrinogénu/fibrindegradačných produktov pomocou novej metódy s protilátkami. Path 25.680-682 (1972).
  19. Bergsdorf, N., Nilsson, T., Wallen, P.: Imunoanalýza na vyhodnotenie tkanivového plazminogénneho aktivátora použitého u pacientov s trombembolickou chorobou. Thromb. Heamostas. 50:740-744 (1983).
  20. Sherry, S .: Trombolytické enzýmy pre akútne situácie pri vznikajúcom infarkte myokardu: Porovnávanie efektov. Rational Drug Ther.21:1-7(1987)
  21. Sherry, S .: Rekombinantný tkanivový plazminogénny aktivátor (rt-PA): Je to trombolytický enzým voľby pri vznikajúcom akútnom infarkte myokardu? Am. J.Cardiol. 59:984-989 (1987)
  22. Fearnley, G.R., Balmforth, G., Fearnley,E: Dôkaz diurnálneho fibrinolytického rytmu: jednoduchá metóda merania prírodnej fibrinolýzy. Clin.Sci. 16:645-650 (1957).
  23. Ohkuro,I ., Komatsuzaki, T.: Kuriyama, S ., Kawashima,M.: Úroveň aktivity sérového lyzozómu u zvierat kŕmených diétou obsahujúcou natto bacilli. Med.biol.(japonsky) 102:335-337 (1981).
  24. Národná federácia pre výskum natto: Historické záznamy o natto, str. 1-387 (Food Pionia, Natto Research Center, Tokyo 1977).
  25. Nitani, H., Suzuki, A ., Konda, C., Taniguchi, T., Inagaki, J., Kimura, K .: Protinádorový efekt urokinázy a mitomycínu C. Saishin Igaku (japonsky) 23:2168-2172 (1968).
  26. Minshewg, Z ., Kewei, W.: Efekt hypertermie na 912 a KU 2386 in vivo a in vitro. 5 internistické sympózium, Kyoto, 1988, abstr. Str. 42-b-8
      na začiatok stránky
Imunotop s.r.o.; Račianské mýto 1/B; 831 02 Bratislava; tel.: 02 / 4463 5707; fax: 02 / 4463 5708; e-mail: imunotop@imunotop.sk
Design & code by Dusan Tudik - T&T WebDesign
hosted by Yegon