1. Nový fibrinolytický enzým (nattokináza) v rastlinnom syre Natto - typická a populárna potravina vyrobená zo sóje v japonskej diéte
  2. Fibrinolytický efekt tradičného japonského jedla "Natto" (nattokináza)
  3. Zvýšenie fibrinolytickej aktivity v krvnej plazme pri perorálnom podávaní nattokinázy 1
  4. Efekt natto diéty na krvný tlak
  5. Efekt NKPC, lieku vyrobeného zo sušeného filtrátu čiastočne destilovaného Bacillus subtilis, na fluiditu krvi
  6. Nový silný fibrinolytický enzým (nattokináza) v rastlinnom syre "Natto"
  7. Trombóza v tehotenstve a jej prevencia
  8. Purifikovaný filtrát z kultúry Bacillus subtilis natto
    Nový druh "nattokinázy"
  9. Nový proteín získaný z Bacillus subtilis natto s antitrombotickými a fibrinolytickými účinkami
  10. NKCP hrá pri prevencii trombózy dvojitú úlohu
  11. Rizikové faktory kardiovaskulárnych ochorení



1. Nový fibrinolytický enzým (nattokináza) v rastlinnom syre Natto - typická a populárna potravina vyrobená zo sóje v japonskej diéte
H. Sumi, H. Hamada
(Oddelenie fyziológie, Lekárska fakulta, Miyazaki 889-16, Japonsko)
H. Tsushima, H. Mihara a H. Muraki
(Oddelenie základných prírodných vied, Univerzita vied, Okayama 700, Japonsko, oddelenie fermentačných technológií, Fakulta chemických technológií, Yamanashi Univerzita, Kofu 400, Japonsko, 23 júna 1986)

Súhrn
V rastlinnom syre Natto, čo je typická sójová potravina v Japonsku, bola dokázaná silná fibrinolytická aktivita. Priemerná aktivita bola vypočitaná pri 40 CU (plazmínové jednotky)/g mokrej váhy. Nový fibrinolytický enzým, pomenovaný nattokináza, bol ľahko extrahovateľný izotonickým roztokom NaCl. Molárna hmotnosť nattokinázy je 20,000, pH 8,6. Nattokináza prejavovala nielen aktivitu pri fibrinolýze, ale i pri plazmínovom substráte H-D-Val-Leu-Lys-pNA (S -2251), čo dokazuje vyššiu senzitivitu na daný enzým ako ostatné skúšané substráty. Na inhibíciu nattokinázy ako fibrinolytického enzýmu bol vysoko účinný diisopropyl fluorofosfát a 2, 2, 2 - trichloro-1-hydroxyethyl-o , o - dimethylfosfát.

Kľúčové slová: Natto, sójová potravina, fibrinolytický enzým, serínová proteáza

Rastlinný syr Natto (1) je typická a populárna sójová fermentovaná potravina v Japonsku. Jej história sa začala písať pred viac ako 2000 rokmi, vzhľadom k špeciálnej, veľmi obľúbenej chuti a vôni spôsobenej mikroorganizmom Bacillus natto. (1,2). V tradičnej ľudovej medicíne sa táto potravina využívala aj pri liečení srdcových a cievnych onemocnení, na prevenciu vyčerpanosti a ako prevencia chorobe beri-beri (2). Bol popísaný i hypotenzívny efekt u SHR potkanov (3) a predĺženie strednej dĺžky života u myší s Ehrlichovým sarkomom (4). V súčasnosti však neexistuje štúdia o komponentoch proteáz, okrem predbežnej štúdie Miyakea s kazeinovými a gelatinovými substrátmi enzýmov (5, 6). V tejto štúdii je demonštrovaná prítomnosť silného fibrinolytického enzýmu v Natto po prvý krát a je popísané skúmanie viacerých enzymatických vlastností tohoto nového enzýmu.

Materiál a metódy
Boli použité nasledujúce látky:
- Natto vyrobené Samejima Shoji Co. Ltd., Japonsko
- trypsin (typ 1) z pankreasu prasiat a diisopropyl fluorofosfát (DFP) vyrobený Sigma Chemical Co., USA
- 2, 2, 2 - trichloro-1-hydroxyethyl-o , o - dimethylfosfát (Neguvon) vyrobený Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japonsko
- kyselina є - aminokapronová, (є- ACA) a kyselina trans - 4 - aminomethy - cyclohexanekarboxylová (t-AMCHA) vyrobená Daiichi Seiyaku Co.Ltd., Japonsko
- ľudský plazmín a urokináza vyrobená Green Cross Co., Japonsko
- Bz-DL-Arg-pNA vyrobená nadáciou na výskum proteínu, Osaka Univerzita v Japonsku
- pyro-Glu-Gly-Arg-pNA (S -2444), pyro-Glu-Pro-Val-pNA (S -2428), H-D-Val-Leu-Lys-pNA (S -2251), H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S -2238), H-D-Val-Leu-Arg-pNA (S -2266) - a H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (S -2302) vyrobená Kabi Group, Inc. USA

Všetky ostatné chemické látky boli získané komerčným nákupom v najlepšej možnej kvalite dostupnej na trhu. Aktivita amidázy bola hodnotená koloritmetricky, použitím viacerých syntetických amidosubstrátov (7): reakčná zmes (1 ml) pozostávala zo vzorky enzýmu 5x10-4 M substrátu a 0.1 M fosfátového pufru, obsahujúceho 0.1 M NaCl, pH 7.4. Fibrinolytická aktivita bola podmienená Milstonovou metódou (8), používajúcou štandardné sklíčko s fibrínom (9). Koncentrácia proteínu bola určovaná metódou podľa Lowryho a spol. (10), používajúc albumín kravského séra (Armour Pharmaceutical Co.) ako referenčný proteín. Filtrácia gélu bola vykonávaná stĺpcom (1.0 x 25 cm), vyrobeným Sephadex G-100 (Pharmacia Chemicals), kalibrovaným a používaným s 0.1 M fosfátovým pufrom obsahujúcim 0.2 M NaCl, pH 7,4. Izoelektrické fokusovanie bolo vykonávané metódou Vesterberga a Svenssona (11), používajúc amfolyty s pH 3,5-10,5.

Výsledky a diskusia
Bola dokázana silná fibrinolytická aktivita po aplikovaní Natto priamo na štandardné sklíčko s fibrínom (obrázok A ). Fibrinolytický enzým (nattokináza) je ľahko extrahovateľný izotonickým roztokom NaCl (obrázok B). Vypočítaná fibrinolytická aktivita z extraktu extrahovaného z jedného gramu vlhkého Natto je porovnateľná s 40 CU plazmínu alebo 1600 IU urokinázy, pri prepočte na štandardný fibrinolytický enzým. Nattokináza bola relatívne stála pri neutrálnom pH i v surovom stave, avšak bola postupne inaktivovaná teplotou nad 60 stupnov Celzia. (obrázok C). Až 95 % enzymatickej aktivity nattokinázy pretrvávalo i po 5 cykloch zmrazovania a rozmrazovania. Pri neutrálnom a zásaditom pH (hodnoty 7-12), bola nattokináza stabilná pri izbovej teplote 10 minút, ale bola labilná pri pH nižšom ako 5,0. Pridaním niektorých substancií ako napr. varený extrakt ryže, varený extrakt mäsa, sérový albumín a žaludočný mucín (1-50 mg suchej hmotnosti/ml), sa stabilita nattokinázy výrazne predlžovala a jej enzýmová aktivita nebola úplne inhibovaná (v každom prípade pretrvávalo viac ako 7,5 % originálnej aktivity) dokonca i v kyslom prostredí.
Enzýmová aktivita nebola zmenená pri alebo bez použitia 5mM Cys, ale 1mM DFP a 5 mM Neguvon kompletne inhibovali fibrinolýzu, potvrdzujúc predpoklad, že nattokináza je serínová proteáza. V ďalších pokusoch typické anti-plazmín agenty є-ACA a t-AMCHA (12,13) nevykazovali žiaden efekt na fibrinolýzu pri rovnakých podmienkach (konečná koncentrácia , 50 mM, pri vzorke aplikovanej na štandardné sklíčko s fibrínom).
Amidolytická aktivita nattokinázy bola skúmaná pri použití viacerých syntetických substrátov. Ako je ukázané v tabuľke, najcitlivejší substrát bol plazmínový S -2251, s nižším efektom pre Bz-DL-Arg-pNA, S -2238, S -2266, S -2302. Nebola dokázaná takmer žiadna aktivita pri substráte urokinázy S -2444 alebo substráte elastázy S -2484.

Gélovou filtráciou pri použití Sephadex G-100 bolo potvrdené, že nattokináza má molekulárnu hmotnosť 20 000. Pri pokračovaní purifikácie aktívnej frakcie izoelektrickou fokusáciou bola dokázaná symetrická fibrinolytická aktivita pri pH 8,6.
V súčasnej štúdii, bola demoštrovaná prítomnosť nového fibrinolytického enzýmu, nattokinázy, v Natto. Využitie Natto pre rôzne účely v ľudovej, tradičnej medicíne môže mať vzťah k efektom tohto silného enzýmu. Viaceré fibrinolytické enzýmy, ako napr. urokináza (14,15) a proteáza (16) vykazovali vysokú efektivitu pri fibrinolýze plazmy pri perorálnom podávaní. Obyčajne sú používané s viacerými stabilizujúcími látkami, ako napr. sérový albumín, alebo žalúdočný mucín a sú obalené protektívnymi látkami zabraňujúcimi rozpusteniu v žalúdku. Sú absorbované do plazmy cez gastrointestinálny trakt a zároveň indukujú urokináze podobný endogénny plazminogénny aktivátor v plazme, pravdepodobne vo vnútornej výstelke ciev alebo pečeni (15). Nattokináza môže byť rovnako kvalitná proteáza pri perorálnom podávaní na fibrinolytické terapeutické účely vzhľadom k jej potvrdenej bezpečnosti pre dlhodobé užívanie, stabilitu a silnú fibrinolytickú aktivitu potvrdenú v testoch. Ďalšie in vivo pokusy s nattokinázou momentálne pokračujú.


Fibrinolytická aktivita nattokinázy
  1. Natto bolo aplikované priamo na štandardné sklíčko s fibrínom
  2. Nattokináza bola extrahovaná z 300 g natto, použitím 220 ml izotonického roztoku NaCl miešaním počas 15 minút pri 4 °C. Následne bol extrakt filtrovaný cez gázu a centrifugovaný pri 3000 otáčkach/min počas 10 minút. N, nattokinázový extrakt, 21,0mg protein/ml, P, plazmínový štandard 4.0CU/ml, U, urokinázový štandard, 100IU/ml, aplikované na štandardné sklíčko s fibrínom (podľa poradia)
  3. Nattokinázový extrakt bol vystavený pôsobeniu tepla vyznačených v °C na dobu 10min., a následne aplikovaný na štandardné sklíčko s fibrínom. Objem každej vzorky bol 10 џl, inkubačná doba bola 18 hodín pri teplote 37 °C
Porovnanie amidolytickej aktivity nattokinázy použitím viacerých syntetických substrátov
SubstrátHydrolýza substrátu (nmo/min/ml)
H-D-Val-Leu-Lys-pNA (S -2251)68,5
Bz-DL-Arg-pNA18,0
H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S -2238)14,0
H-D-Val-Leu-Arg-pNA (S -2266)13,5
H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (S -2302)11,5
Pyro-Glu-Gly-Arg-pNA (S -2444)0
Pyro-Glu-Pro-Val-pNA (S -2484)0

Reakčná zmes (1ml) obsahovala 20 џl extraktu nattokinázy (420 џg proteínu), 5x10-4 M substrátu a 0,1 M fosfátového pufru, pH 7,4. Po 10 minútovej inkubácii pri 37°Celzia, bol získaný p-nitroanilín uvoľnený pri absorbcii 405 nm. Výsledky sú vyjadrené v nmoloch substrátu hydrolizovaného počas 1 min. z 1 ml nattokinázového extraktu. Každá hodnota je priemerom 3 determinujúcich hodnôt.
  1. Yabe, K ., Bull. Coll. Agr. Tokyo Univ.2 (1894)2.
  2. National Federation of Cooperatives on Natto, in : A .Historické záznamy o Natto, str. 19, Ed. Food Pionia, Natto výskumné centrum, Tokyo 1977
  3. Hayashi, W.,Natto Kagakukenkyu Kaishi (v japončine)1(1977) 85.
  4. Kameda, S .,Chem.pharm.Bull.16 ())1968)189.
  5. Miyake,S ., a Shimizu, J.,bull. Hyogo Agr.Coll. (v japončine)1(1953)11.
  6. Miyake,S ., Watanabe,K ., Yoshikawa,M., a Nonoguchi,k Y., Seikagaku (v japončine)28 (1965)527.
  7. Claeson,g.Friberger,P.,Knos,M., a Eriksson, E.,Haemostassis 7(1978)76
  8. Milstone,H.,J.Immun,42 (1941)109.
  9. Astrup,t., a Mullertz,S .,Archs Biochem.Biophys.40(1952)346.
  10. Lowry,O .H.,Rosebrough,N.J.Farr,A .L., a Randall, R.J., J.biol.Chem. 193 (1951)265.
  11. Vesterberg,O ., a Svensson,H., Acta chem.scand. 20 (1966)820.
  12. Okamoto,S .,Sato,S .,Takada,Y a Okamoto,U.,Keio J.Med.13 (1964)177.
  13. Okamoto,S ., a Hijikata,A .,Drug Design 6 (1975)143.
  14. Sumi,H.,Sasaki,K .,toki,N., a Robbins,K .C., Thromb.Res.20 (1980)711.
  15. Toki,N.,Sumi,H.Sasaki,K .,Boreisha,I ., a Robbins,K .C.,J.clin.Invest.75(1985)1212.
  16. Mihara,H., Sumi,H., Akazawa,K .,Yoneta,T., a Mizumoto, H., Thromb. Haemost. 50 (1983)
      na začiatok stránky
Imunotop s.r.o.; Račianské mýto 1/B; 831 02 Bratislava; tel.: 02 / 4463 5707; fax: 02 / 4463 5708; e-mail: imunotop@imunotop.sk
Design & code by Dusan Tudik - T&T WebDesign
hosted by Yegon