1. Nový fibrinolytický enzým (nattokináza) v rastlinnom syre Natto - typická a populárna potravina vyrobená zo sóje v japonskej diéte
  2. Fibrinolytický efekt tradičného japonského jedla "Natto" (nattokináza)
  3. Zvýšenie fibrinolytickej aktivity v krvnej plazme pri perorálnom podávaní nattokinázy 1
  4. Efekt natto diéty na krvný tlak
  5. Efekt NKPC, lieku vyrobeného zo sušeného filtrátu čiastočne destilovaného Bacillus subtilis, na fluiditu krvi
  6. Nový silný fibrinolytický enzým (nattokináza) v rastlinnom syre "Natto"
  7. Trombóza v tehotenstve a jej prevencia
  8. Purifikovaný filtrát z kultúry Bacillus subtilis natto
    Nový druh "nattokinázy"
  9. Nový proteín získaný z Bacillus subtilis natto s antitrombotickými a fibrinolytickými účinkami
  10. NKCP hrá pri prevencii trombózy dvojitú úlohu
  11. Rizikové faktory kardiovaskulárnych ochorení



9. Nový proteín získaný z Bacillus subtilis natto s antitrombotickými a fibrinolytickými účinkami
Kazunobu Omura1*, Masahito Hitosugi1, Xia Zhu2, Masashi Ikeda3, Hiroaki Maeda2 a Shogo Tokudome1
1 Oddelenie súdneho lekárstva, Lekárska fakulta Univerzity Dokkyo, 880 Kita-Kobayashi, Mibu, Tochigi 321-0293, Japonsko
2 Oddelenie pre výskum a vývoj, Farmaceutická spoločnosť Daiwa, Ltd., 1-16-19 Sangenjaya, Setagaya-ku , Tokyo 154-0024, Japonsko
3 Ústav lekárskych vied, Lekárska fakulta Univerzity Dokkyo, 880 Kita-Kobayashi, Mibu, Tochigi 321-0293, Japonsko

Predložené 18. apríla 2005, prijaté 13 septembra 2005
*Autor, ktorému sa zasiela korešpondencia. FAX: +81-282-86-7678, e-mail: omura@dokkyomed.ac.jp


Abstrakt
Natto, dusené sójové bôby fermentované pomocou Bacillus subtilis natto, je tradičná japonská potravina. Z fermentácie B.subtilis natto sme získali purifikovanú proteínovú vrstvu pod obchodnou značkou NKCP. V tejto štúdii sme skúmali fibrinolytické a antitrombotické účinky NKCP a zisťovali aktívne zložky tejto látky, aby sme objasnili fibrinolytický účinok NKCP, ktorý bol pozorovaný v predchádzajúcich predbežných klinických skúškach. Ako aktívna zložka KNCP bola identifikovaná bielkovina o molekulovej hmotnosti 34 kilodaltonov, ktorá bola označená ako bacilopeptidáza F. NKCP vykazoval v soľnom prostredí priamy rozkladný účinok na umelú zrazeninu. Proteázová aktivita, ktorá je základom fibrinolytického pôsobenia NKCP, bola skúmaná pomocou chromogénneho substrátu pre plazmín. U potkanov, ktorým sa podala NKCP do dvanástorníka, sa pozorovalo dávkovo závislé predĺženie protrombínového času a aktívneho parciálneho tromboplastínového času. Naše in vitro i in vivo štúdie ukázali, že NKCP má tak fibrinolytický účinok ako aj antitrombotický účinok podobný heparínu. Keďže NKCP pochádza z potraviny a keďže boli v predchádzajúcich pokusoch na zvieratách i predbežných klinických skúškach získané údaje o jej bezpečnosti, považuje sa táto látka za bezpečnú pre klinické používanie.
Kľúčové slová: bacilopeptidáza F, antitrombotický účinok, fibrinolýza, Natto, Bacillus subtilis natto

Úvod
Natto, tradičná japonská potravina vyrobená z nakvasených sójových bôbov, priťahuje pozornosť ako výživná potravina s obsahom mnohých peptidov a aminokyselín. Bacillus subtilis natto, baktéria izolovaná z natto, vylučuje počas kvasného procesu viacero proteáz. Nattokináza, fibrinolytický enzým extrahovaný z natto, bola skúmaná ako možná látka pre klinické využitie (1-3). V modeli na psoch zvýšilo perorálne podanie nattokinázy vo forme toboliek fibrinolýzu v plazme (1). Bol síce popísaný fibrinolytický účinok extracelulárnych proteáz z Bacillus subtilis natto, neboli však popísané antitrombotické účinky (4-6).
Z vykvasenej substancie B.subtilis, podčeľaď Subtilis kmeň 168, sme získali purifikovanú proteínovú vrstvu označenú NKCP (chránená známka Daiwa Pharmaceuticals Corp.); je to acelulárny prášok bez vitamínu K . V predchádzajúcich klinických štúdiách, v rámci ktorých bola NKCP podávaná 28 dobrovoľníkom počas dvoch týždňov a 23 dobrovoľníkom počas viacerých mesiacov (7) sme pozorovali fibrinolytický účinok so skrátením času lýzy euglobulínov ľudskej krvi.
Na objasnenie detailného mechanizmu pôsobenia NKCP na zrážanie krvi a fibrinolytický systém sme v tejto práci skúmali antitrombotické a fibrinolytické účinky NKCP a stanovili sme jej účinné zložky.

Materiál a metódy
Identifikácia hlavnej zložky NKCP
NKCP (Daiwa Pharmaceuticals Corp., Tokyo) bola fermentovaná Bacillus subtilis podčeľaď Subtilis, kmeň 168 z kvasenia Natto, konzervovaného zmrazením a naočkovaného na agarové platne. Po fermentácii v jemnozrnných sójových bôboch a glukózovom médiu počas 2 dní pri 42°C sa získala jemná proteínová vrstva ako supernatant centrifugácie a ultrafiltrácie cez molekulárne sito (10.000 mol). Po dehydratácia supernatantu pomocou podtlaku sme získali NKCP vo forme prášku.
Pre proteínovú analýzu sme frakcionovali NKCP pomocou hydrolýzy s S -2251 (H-D-valyl-L-leucyl-L-lyzín-p-nitroanalín dihydrochlorid; Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., Tokyo), ako je to popísané ďalej. Pri analýze proteínov pomocou gélovej elektroforézy v 10 – 20% sodnom dodecylsulfátovom polyakrylamide (SDS-PAGE, Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.), sme zistili jednu hlavnú čiaru s hodnotou 45 kilodaltonov. Hlavnú čiaru SDS-PAGE sme izolovali pomocou frakcionácie opakovanou stĺpcovou chromatografiou pomocou SuperQ-Toyopearl 650M, Butyl-Toyopearl 650M a Toyopearl HW-50F (Tosoh Corp., Tokyo).
Molekulovú hmotnosť proteínu sme stanovili na základe merania laserového desorpčného ionizačného času pomocou matrice na hmotovom spektrometri (Voyager Elite/STR; Per-Septive Biosystems, Inc., Framingham, MA, USA). Aminokyselinovú sekvenciu proteínu sme stanovili pomocou rozkladovej metódy podľa Edmana s použitím sekvencéra aminokyselín (PPSQ21; Shimadzu Corp., Kyoto). Pre vnútornú analýzu sekvencie aminokyselín sme proteín jemne rozložili pomocou lyzylendopeptidázy (Wako Pure Chemical Industries, Osaka).
Po identifikácii hlavného proteínu NKCP sme za účelom štandardizácie jeho množstva použili kvantitatívnu metódu enzýmového imunosorpčného testu (ELISA) s králičími polyklonálnymi protilátkami (Sima Laboratories Corp., Tokyo). Vzorky rozpustené vo fosfátovom nárazníkovom roztoku sme nakvapkali na mikroplatničky s 96 jamkami potiahnutými vrstvou imobilizovaných protilátok a inkubovali sme ich 90 minút pri teplote miestnosti. Po premytí fosfátovým nárazníkovým roztokom na odstránenie nenaviazaných proteínov sme pridali protilátku konjugovanú s peroxidázou a inkubovali 60 minút pri teplote miestnosti. Po ďalšom premytí sme pridali čerstvo pripravený roztok substrátu s obsahom o -fenyléndiamínu a peroxidu vodíka v citrát-fosfátovom nárazníku a inkubovali 30 minút pri teplote miestnosti. Potom sme na zastavenie reakcie pridali 2N kyselinu sírovú. Test sme kvantifikovali pomocou merania absorbancie pri 490nm.

Hodnotenie fibrinolytického účinku
Fibrinolytický účinok NKCP sa skúmal pomocou rozkladu umelej krvnej zrazeniny. Umelú krvnú zrazeninu sme pripravili spontánnou koaguláciou čerstvej ľudskej krvi v sklenenej skúmavke; krv sme odobrali zdravým mladým dobrovoľníkom – mužom po získaní písomného informovaného súhlasu. O hodinu neskôr sme opakovane premyli umelú krvnú zrazeninu. Umelú krvnú zrazeninu sme namočili do roztoku NKCP (0,1 mg/ml) a ponechali pri teplote miestnosti. Ako kontrolu sme namiesto NKCP použili normálny fyziologický roztok.

Hodnotenie aktivity serínproteázy Serínproteázová aktivita NKCP sa hodnotila pomocou S -2251 ako chromogénnového substrátu pre plazmín a streptokinázou aktivovaného plazminogénu. Serínproteázová aktivita bola stanovená na základe rozdielu absorbancií za minútu (pri 405nm) medzi vytvoreným p-nitroanilínom a pôvodným substrátom. Zmes vzorky v roztoku 0,1 ml + 0,2 ml 0,1M Tris pri pH 9,0 a 5mM roztoku chromogénneho substrátu sme inkubovali pri 27°C 5 min. a pridali sme citrát na zastavenie reakcie. Ako kontrolu sme namiesto vzorky použili 2% roztok citrátu. Jedna jednotka serínproteázovej aktivity bola definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré vytvorí 1 nmol p-nitroanilínu za minútu pri 37°C.

Hodnotenie antitrombotického účinku Antitrombotický účinok NKCP bol hodnotený na 8 týždňových potkanoch- samcoch kmeňa Sprague-Dawley. Potkanom bola podaná anestézia a do abdominálnej aorty sme im zaviedli 10 cm dlhú zasľučkovanú polyetylénovú kanylu, ktorá indukovala trombózu s poškodením endotelu a poruchou prietoku krvi. Obštrukciou pyloru a distálneho konca dvanástorníka sme vytvorili uzavretú duodenálnu sľučku (8,9). Pozitívnu (hypoprotrombinemickú) kontrolu sme pripravili tiež z 8-týždňových potkanov – samcov kmeňa Sprague-Dawley podaním roztoku 0,65 mg/l sodnej soli warfarínu (Eisai Corp., Tokyo); tento roztok sme podávali potkanom ako pitný roztok počas jedenástich dní pred zavedením kanyly.
Pomocou fyziologického roztoku sme pripravili roztok NKCP o konečnej koncentrácii 0 (kontrola), 5, 25, 100 a 250 mg/kg a podávali sme ho priamo do uzatvorenej duodenálnej sľučky 2 hodiny po zavedení kanyly 6 potkanom. Šesť hodín po podaní NKCP sme z aorty odobrali vzorky krvi s okamžitým pridaním citrátu. Stanovili sme protrombínový čas (PT) a aktívny parciálny tromboplastínový čas (APTT), index trombotickej tendencie. Na štatistickú analýzu sme použili Williamsov test na porovanie výsledkov získaných zo vzoriek krvi zvierat, ktorým sa podal kontrolný roztok a rôzne koncentrácie NKCP. Výsledky sme vyjadrili ako priemer  štandardná chyba priemeru.

Výsledky
Identifikácia hlavnej zložky
Molekulová hmotnosť hlavnej zložky NKCP bola zistená 34.134 daltonov. Sekvencia aminokyselín bola analyzovaná na 85 rezíduách od N-konca. Tri peptidy získané rozkladom pomocou lyzylendopeptidázy boli analyzované rovnakou metódou. Porovnaním získaných sekvencií s génovou databázou B.subtilis bolo zistené, že že hlavná zložka NKCP je 34-kilodaltonový fragment bacilopeptidázy F (10,11), extracelulárna serínproteáza vylučovaná B.subtilis po rastovej fáze bunky (Obr.1). Priradená sekvencia aminokyselín obsahovala tiež tri katalytické zvyšky bacilopeptidázy F (Asp, His a Ser), ktoré boli zistené v rôznych serínproteázach, napr. subtilizíne.

Hodnotenie fibrinolytického účinku Rozklad krvnej zrazeniny sa sledoval v skúmavke s NKCP ako uvoľnenie červených krviniek zachytených vo viacnásobnej sieti fibrínu. V skúmavke s fyziologickým roztokom sa do 60. minúty nepozoroval žiaden rozklad krvnej zrazeniny (Obr. 2).

Hodnotenie serínproteázovej aktivity Priemerná serínproteázová aktivita bola 1800 jednotiek na gram NKCP. Na základe merania pomocou ELISA bola priemerná serínproteázová aktivita 11,1 jednotiek na 239,9 g 34-kilodaltonovej bacilopeptidázy F (n=6).

Hodnotenie antitrombotických účinkov Hodnota PT a APTT neovplyvnených potkanov bola 16,2 0,2 a 33,4  1,7 s (n=6). U potkanov s hypoprotrombinémiou vyvolanou podávaním sodnej soli warfarínu bola hodnota PT 35,45,4 hodnota APTT bola 52,96,8 s (n=6). NKCP predĺžila PT dávkovo závislým spôsobom z hodnoty 170,4 s pri dávke 5 mg/kg na maximálne 21,31,7 pri dávke 250 mg/kg. Aj APTT sa predĺžil dávkovo závislým spôsobom, z 36,64,3 s pri dávke 5 mg/kg na maximálne 63,42,9s pri dávke 250 mg/kg (Obr. 3). Pri dávke 5 mg/kg a vyššej bola hodnota PT významne predĺžená v porovnaní s kontrolou, hodnota APTT bola významne vyššia ako kontrolné hodnoty pri dávkach 25 mg/kg a vyšších (P<0,05).

Diskusia
NKCP bola získaná z fermentačného média B.subtilis natto. B.subtilis natto produkuje po ukončení exponenciálneho rastu viacero extracelulárnych proteáz. Predpokladá sa, že veľké množstvá extracelulárnych proteáz secernovaných B.subtilis vytvárajú heterogénne proteíny, ktoré využíva hostiteľský organizmus. Množstvo extracelulárnych proteáz však spôsobuje rýchly rozklad cudzorodých proteínov. Bacilopeptidáza F je jednou z týchto extracelulárnych proteáz a bola izolovaná z B.subtilis v rôznych formách (10-12).
Možno teda povedať, že hlavnou zložkou NKCP je 34-kilodaltonová serínproteáza, bacilopeptidáza F, ktorá bola stanovená na základe sekvencie aminokyselín a prítomnosti katalytického centra, t.j. Ser, His a Asp, čo je aktívne miesto serínproteázy (10,11). Naviac, predpokladá sa, že NKCP je fibrinolytický enzým, keďže priamo rozkladá fibrínovú zrazeninu a chromogénny substrát. Tieto výsledky sú teda v súlade so zisteniami predchádzajúcich klinických skúšok (7). Keďže fibrnolýza sa aktivuje tiež prostredníctvom aktivácie zrážania krvi v rámci rovnováhy medzi zrážaním krvi a fibrinolýzou, skúmali sme ďalej účinok NKCP na systém zrážania krvi.
Naše výsledky naznačujú, že NKCP má antitrombotický účinok a pri priamom podaní do dvanástorníka potkanov predlžuje PT i APTT. Keďže NKCP inhibuje dávkovo závislým spôsobom tak vonkajšiu ako aj vnútornú cestu koagulácie, antitrombotický účinok nie je sekundárnym mechanizmom v dôsledku nadmernej fibribolýzy. Naše výsledky síce poukazujú na antitrombotické pôsobenie, na preskúmanie podrobného mechanizmu tohto deja budú potrebné dalšie štúdie. Podľa našich informácií sú naše štúdie vôbec prvými, ktoré popisujú antitrombotické a fibrinolytické pôsobenie tohto novozískaného proteínu. My sme sa v tejto práci pokúsili preskúmať priaznivé pôsobenie perorálneho podania NKCP pripravenej z Natto.
Keďže NKCP pochádza z potraviny a jej bezpečnostné údaje u zvierat sú priaznivé (t.j. údaje o akútnej a subakútnej toxicite, teste na antigénnosť na morčatách, ako aj predbežné klinické skúšanie na dobrovoľníkoch), pokladáme NKCP za bezpečnú pre klinické použitie (7). Naše pokusy in vitro aj in vivo ukázali, že NKCP má tak fibrinolytické ako aj antitrombotické účinky, podobne ako heparín (13) Štúdie in vivo budú potrebné na preskúmanie schopnosti NKCP zabrániť trombotickým ochoreniam.
      na začiatok stránky
Imunotop s.r.o.; Račianské mýto 1/B; 831 02 Bratislava; tel.: 02 / 4463 5707; fax: 02 / 4463 5708; e-mail: imunotop@imunotop.sk
Design & code by Dusan Tudik - T&T WebDesign
hosted by Yegon